Informations scientifiques sur l'inflammation

Présenté par Benoît RAYMOND
Thèse soutenue le 18 Janvier 2008
Dr. Lhousseine Touqui, Directeur de thèse
Unité de défense innée et inflammation, Inserm U874, Institut Pasteur, Paris.

L’inflammation est l’une des premières lignes de défense ayant pour but d’éradiquer un pathogène lors d’un processus infectieux. Cependant, l’inhalation de Bacillus anthracis engendre une pathologie souvent fatale associée à un état septique et toxémique : c’est le charbon d’inhalation ou anthrax pulmonaire. Cette observation suggère que les systèmes de défense pulmonaire, comme l’inflammation, sont inefficaces vis-à-vis d’une infection par le bacille du charbon. Il était donc nécessaire d’identifier les mécanismes impliqués dans la dérégulation de la réponse inflammatoire. En absence de toxines, nous avons montré que le bacille du charbon a la capacité à induire l’expression de la phospholipase A2 sécrétée de type IIA (sPLA-II2) et de l’interleukine-8 (IL-8). Nous avons également démontré que ce microorganisme modifie le comportement des cellules épithéliales et phagocytaires en sécrétant les toxines œdématogène (ET) et létale (LT). Nous avons, en particulier, étudié les mécanismes moléculaires et cellulaires de l’inflammation qui expliquent, en partie, le maintien de l’intégrité pulmonaire. Par l’utilisation conjuguée de modèles expérimentaux de charbon pulmonaire et de modèles in vitro, nous avons pu identifier les mécanismes par lesquels ET et LT dérégulent différents aspects de la défense anti-infectieuse pulmonaire. ET inhibe l’expression de la sPLA2-IIA, enzyme inflammatoire produite par les macrophages alvéolaires et possédant un fort pouvoir bactéricide vis-à-vis de B. anthracis. Notre étude nous a également permis d’identifier la voie AMPc/PKA comme étant la voie de signalisation par laquelle ET réprime l’expression de la sPLA2-IIA. LT inhibe quant à elle l’expression de l’IL-8 probablement en régulant le degré de compaction de la chromatine. En inhibant la phosphorylation de l’histone H3, LT aur ait ainsi la capacité à « verrouiller » l’accès de la région promotrice du gène codant pour l’IL-8 au facteur de transcription NF- k B. Dans un contexte infectieux, nous suggérons qu’en fonction du cycle bactérien, B. anthracis est capable d’induire la réponse inflammatoire caractérisée notamment par la sécrétion de la sPLA2-IIA et de l’IL-8. Puis, plus tardivement dans le cycle bactérien, cette bactérie peut inhiber l’expression de ces mêmes facteurs inflammatoires en sécrétant LT et ET lui permettant ainsi de proliférer au sein de l’organisme infecté.

eTUDE DU RECEPTEUR CRTH2 ET DE L’ENZYME PHOSPHODIESTERASE DE TYPE 7 DANS UN MODELE D’ALLERGIE MURIN

L’asthme est une maladie chronique des voies respiratoires caractérisée par une bronchoconstriction aiguë immédiate suivie d’une hyperréactivité bronchopulmonaire (HRB), accompagnée d’une inflammation majoritairement éosinophilique, d’une production de mucus et d’une augmentation d’IgE sériques. Les lymphocytes T CD4+ de type Th2 orchestrent la réponse inflammatoire allergique via la libération de cytokines régulant le recrutement et l’activation des mastocytes et éosinophiles.

L’objectif de ce travail a été de caractériser un nouveau modèle murin adapté à son utilisation pour les explorations pharmacologiques de molécules sélectives et la validation de nouvelles cibles de la pathologie asthmatique par l’utilisation de souris déficientes en un gène déterminé (KO).

Dans un premier temps, nous avons étudié l’inflammation, l’HRB, et la génétique sur ce modèle en comparant les souches de souris C57BL6, majoritairement utilisées dans la genèse de souris transgéniques, et les souris Balb/c, les plus décrites dans de nombreux modèles de sensibilité antigéniques.

Nous nous sommes ensuite intéressés à deux mécanismes pharmacologiques d’intérêt très récent concernant, d’une part, le rôle d’un récepteur nouvellement cloné de la prostaglandine D2 libérée par les mastocytes, le CRTH2 ; et d’autre part, l’implication d’une nouvelle enzyme d’intérêt, la phosphodiesterase de type 7, initialement décrite comme étant impliquée dans la modulation des lymphocytes T et régulant l’AMPc.

Nos résultats ont confirmé l’utilité de ce modèle dans la caractérisation des principaux paramètres reliés à l’asthme et aussi l’importance des différences génétiques dans la réponse à un même protocole. Une absence de corrélation entre l’inflammation éosinophilique et l’HRB ainsi que l’importance de la modulation de la réponse Th1/Th2 est aussi illustré par nos études.

Par ailleurs, nous avons montré par une étude sur des souris déficientes en récepteur CRTH2, son rôle potentialisateur controversé de l’inflammation et une régulation de type homéostasique entre l’expression du récepteur CRTH2 et la production d’IL-5, cytokine connue pour son rôle dans la maturation et le chimiotactisme des éosinophiles.

En outre, l’utilisation de molécules inhibant sélectivement l’enzyme PDE7 et d’animaux génétiquement modifiés nous ont permis d’exclure l’implication de l’enzyme PDE7 dans notre modèle murin allergique.

Ces études nous ont permis de valider la prédictivité d’un modèle simplifié de la pathologie asthmatique chez deux souches de souris très utilisées mais aussi de montrer l’importance (et les limites) de l’utilisation de souris KO, comme étant partie prenante, a fortiori avec le support de molécules spécifiques, dans les décisions visant à influencer la stratégie des projets en recherche pharmaceutique.

Etude de la voie de signalisation activatrice des integrines beta2 et beta3 dans les neutrophiles et les plaquettes.

Les intégrines forment une famille de récepteurs d’adhérence transmembranaires hétérodimériques (formées de deux chaînes a et b). Elles permettent aux cellules d’adhérer à différents substrats de la matrice extracellulaire ou exprimés à la surface d'autres cellules. Les cellules régulent la fonction de leurs intégrines par un contrôle spatio-temporel de leur affinité envers les ligands. Cette dynamique de l’adhérence a une importance particulière pour les plaquettes et les cellules inflammatoires, qui doivent passer très rapidement de l’état de cellules non adhérentes dans la circulation à un état d’adhérence entre elles ou à l’endothélium. Ce passage est accompli par un changement rapide et réversible de la conformation des intégrines, au cours duquel le domaine extracellulaire adopte un état de haute affinité envers le ligand. Ce processus d’activation de l’intégrine est régulé par une signalisation intracellulaire dite « inside-out ». Une fois activée, l’intégrine interagissant avec son ligand intègre des signaux extracellulaires et les transmet à l’intérieur de la cellule, c’est la signalisation « outside-in » responsable des processus d’agrégation, d’adhérence, de migration…

Au cours de mon travail de thèse, je me suis intéressé à l’étude de la signalisation «inside-out» aboutissant à l’activation des intégrines beta2 (a_Mb₂) et beta3 (a_IIbb₃) mise en jeu, respectivement, dans le polynucléaire neutrophile et la plaquette, activés par des agonistes comme le TNF-a (neutrophile) et la thrombine (plaquette). En effet, les cas de syndromes de déficit d’adhérence des cellules hématopoïétiques (LADIII), touchant les intégrines leucocytaires et plaquettaires et dus à un défaut dans la signalisation «inside-out», suggèrent un mécanisme commun d’activation de ces intégrines. Ainsi, nos travaux nous ont permis de mettre en évidence des éléments communs aux voies de signalisation «inside-out» des intégrines beta2 et beta3 et notamment l’implication :

- Des Src kinases : nous avons démontré, par ailleurs, l’activation constitutive de ces kinases dans les neutrophiles et leur mise en jeu aussi bien dans les signalisations «inside-out» que «outside-in» des intégrines beta2.

- Des espèces réactives de l’oxygène (ROS) : la signalisation «inside-out» induite dans le neutrophile et la plaquette met en jeu la production de ROS, par une flavoproyéine oxydase encore inconnue. Les ROS produits agissent comme seconds messagers en régulant l’activation des MAPKp38 dont nous avons démontré, dans le neutrophile, l’implication exclusive dans la voie de l’«inside-out» et non de l’«outside-in».

La mise en évidence de cette voie d’activation commune aux intégrines beta2 et beta3, pourrait conduire à mieux comprendre la voie «inside-out», encore mal connue. Elle pourrait apporter des suggestions quant au(x) défaut(s) de signalisations à l’origine des syndromes de déficit d’adhérence et établir des liens avec d’autres éléments cellulaires de signalisation ou cytosquelettiques connus pour leur implication dans l’activation des intégrines.

Unité de Défense Innée & Inflammation, Inserm E336, Institut Pasteur, Paris.

Un dysfonctionnement du système de défense innée pulmonaire a pour conséquence la survenue de diverses pneumopathies et dans certains cas, la pénétration d’agents pathogènes dans l’organisme. Le poumon est protégé par un système immunorégulateur local, le surfactant pulmonaire qui est un film lipoprotéique sécrété par les cellules épithéliales pulmonaires. Il joue également un rôle essentiel dans le fonctionnement des poumons en abaissant la tension superficielle au niveau des alvéoles évitant ainsi le collapsus alvéolaire en fin d'expiration. La protéine majeure de ce surfactant, appelée SP-A, a la propriété de se lier à divers pathogènes (virus, bactéries et champignons) et favorise ainsi leur élimination par les phagocytes comme les macrophages alvéolaires. Par ailleurs, ces pathogènes sont également reconnus par des récepteurs spécifiques de motifs microbiens, les "Toll-like receptors" (TLRs) exprimés par différentes cellules de l’immunité. Ainsi, la reconnaissance des lipopolysaccharides (LPS), composants majeurs de la membrane externe des bactéries à Gram négatif et de l’ARN double brin (ARNdb), un intermédiaire réplicatif de certains virus, est initiée respectivement par TLR4 et TLR3. La première étude s’est intéressée aux propriétés immunostimulatrices de la SP-A sur les cellules monocytaires.

Nous avons mis en évidence que cette activation cellulaire, associée à une activation du facteur de transcription NF-kB et à la production de cytokines inflammatoires comme le TNF-a et l’IL-10, est dépendante de TLR4 (J. Immunol. 2002; 168 : 5989-92). Ce travail confirme que les TLRs sont non seulement capables d’interagir avec des ligands microbiens mais également avec des molécules de l’hôte.

Puis, deux autres études se sont focalisées sur l’expression et le rôle des TLRs au niveau de l’épithélium pulmonaire (J. Biol. Chem. 2004; 279 : 2712-8 et un autre article a été soumis pour publication). Nous avons ainsi montré par RT-PCR et/ou immuno-empreinte que TLR4 et TLR3 sont constitutivement exprimés dans plusieurs lignées épithéliales respiratoires et la localisation intracellulaire de ces récepteurs a été caractérisée par cytométrie en flux et/ou microscopie confocale. Par ailleurs, nous avons mis en évidence que l’activation de ces cellules par du LPS isolé de Pseudomonas aeruginosa met en jeu les molécules de signalisation MyD88, TRAF6 et les MAPKs ERK1/2, JNK et p38. De même, nous avons démontré que l’activation des cellules épithéliales respiratoires par l’ARNdb ou le virus de la grippe Influenza A est dépendante de TLR3 et implique la molécule adaptatrice TRIF, les MAP-Kinases (MAPK) et la voie PI-3Kinase/Akt. Enfin, l’activation de ces cellules par ces stimuli microbiens conduit à la production de médiateurs inflammatoires comme l’IL-8, l’IL-6 et/ou RANTES. Ces derniers résultats nous permettent de conclure que les TLRs exprimés par l’épithélium respiratoire sont fortement impliqués dans la réponse de l’hôte vis-à-vis de différents pathogènes qu’ils soient d’origine bactérienne ou virale.

En conclusion, l’ensemble de ces travaux soulignent un rôle potentiel des TLRs dans l’immunité innée pulmonaire (cf. figure ci-dessous).

Effets anti-interleukine 1ß in vitro des activateurs des récepteurs activés par les proliférateurs de péroxysomes alpha et gamma (PPARa et g) dans les chondrocytes articulaires: analyse des mécanismes d’action moléculaires.

L’arthrose se définit par une perte macroscopique et microscopique de la structure du cartilage articulaire secondaire à une dégradation des protéines matricielles. Parmi les nombreux médiateurs responsables de cette altération structurelle, les cytokines pro-inflammatoires telles que l’IL1ß et les métalloprotéases (MMPs) occupent une place centrale. Très peu de molécules ont la capacité de s‘opposer aux effets délétères de l’ILb sur les chondrocytes. La rosiglitazone et les fibrates sont respectivement des ligands de PPARg et PPARa. L’un et l’autre ont montré dans d’autres types cellulaires leur capacité à diminuer l’activité de MMPs et/ou à s’opposer aux effets de l’ILb.

Notre objectif a été d’étudier in vitro les réponses métaboliques de chondrocytes traités par de l’IL-1b seule ou en présence de concentrations croissantes de rosiglitazone ou de fibrates. Dans la première partie de ce travail nous montrons que PPARg est fonctionnel dans les chondrocytes. Dix mM de rosiglitazone s’opposent aux effets de l’IL1ß sur la production de PG sulfatés, la production de NO ainsi que sur l’expression de COX2 et des MMPs-1, -3 et -13. En revanche, à faibles concentrations (≤ 1µM), la rosiglitazone inhibe de manière sélective la dégradation des PG, l’expression et l’activité des MMPs. Nous montrons que PPARg régule négativement la transcription de la MMP1 par un mécanisme d’exclusion mutuelle: la liaison de ce récepteur nucléaire sur un élément composite PPRE/AP1- situé en -83 du promoteur de la MMP-1 bloque la fixation du facteur transcriptionnel AP-1 sur son élément de réponse.

Dans la deuxième partie de ce travail, nous montrons que PPARa est fonctionnel dans les chondrocytes. Les effets de fortes concentrations de fibrates sont similaires à ceux observés avec la rosiglitazone sur les paramètres précédemment cités. En revanche, les mécanismes d’action inhibiteurs des fibrates sur l’expression des MMPs sont radicalement différents de ceux obtenus avec la rosiglitazone. En effet, nos résultats suggèrent fortement que cet effet des activateurs de PPARa s’opère via la super-induction d’IL1ra. Nous montrons que le clofibrate, via un mécanisme dépendant de PPARa, augmente l’expression de l’IL1ra induit par l’IL1b. Cet effet implique deux PPREs localisés dans le promoteur de l’IL1ra et les éléments de réponse aux voies de signalisation de NF-kB et C/EBP.

En conclusion, PPARg et PPARa inhibent la dégradation des protéines matricielles induite par IL-1b dans les chondrocytes in vitro, en réprimant l’expression de MMP1 par deux mécanismes différents. Cette répression est due à une compétition de PPARg avec le facteur AP1 sur un site ADN composite au niveau du promoteur de MMP1, tandis que PPARa induit la surexpression du gène de l’IL-1ra. Ces résultats suggèrent que la rosiglitazone et les fibrates pourraient retarder les processus de dégradation du cartilage chez des patient(e)s arthrosiques.

IMPLICATION DE LA MÉTALLOÉLASTASE DU MACROPHAGE OU MMP-12 DANS LES PROCESSUS INFLAMMATOIRES DU SYSTÈME RESPIRATOIRE.

La broncho-pneumopathie chronique obstructive ou BPCO est une pathologie qui se caractérise par le développement d’une bronchite chronique associée ou non à des lésions emphysémateuses. Chez ces patients se développe une réaction inflammatoire intense faisant intervenir des cellules inflammatoires telles que les macrophages, les neutrophiles et les lymphocytes. Des enzymes protéolytiques capables de dégrader les composants de la matrice extracellulaire sont libérées par ces cellules. Parmi ces enzymes, la métalloélastase du macrophage ou MMP-12 semble jouer un rôle prépondérant dans la destruction tissulaire qui accompagne la formation des lésions emphysémateuses. A côté de cela, peu de choses sont connues concernant l’implication de la MMP-12 dans la réaction inflammatoire associée.

Au cours de cette thèse, nous avons étudié le potentiel pro-inflammatoire de la MMP-12. Nous avons montré que l’instillation de cette protéase dans les voies aériennes de souris s ‘accompagne d’une réaction inflammatoire que l‘on peut décomposer en deux phases. La phase inflammatoire précoce est caractérisée par un recrutement majeur de neutrophiles, la libération de cytokinines et l’augmentation de l’activité des gélatinases. Elle est suivie d’une phase inflammatoire tardive caractérisée par un recrutement majeur de macrophages. Par ailleurs, nous avons montré que des composés anti-inflammatoires, corticoïde ou inhibiteur de phosphodiestérases IV, sont capables d’inhiber uniquement la phase inflammatoire précoce alors que la marimastat, inhibiteur large spectre des MMPs, est capable d’inhiber les deux phases inflammatoires. Enfin, nous avons montré que ni la déplétion des macrophages résidents, ni la déplétion des neutrophiles n’avaient d’influence sur le recrutement tardif des macrophages. Nous avons également proposé que les cellules épithéliales soient la cible directe de la MMP-12.

Ces résultats renforcent l’hypothèse de l’utilisation de la MMP-12 comme la cible thérapeutique dans la prise en charge de la BPCO.

INTERACTIONS DU "PROTEINASE-ACTIVATED RECEPTOR" 2 AVEC LES PROTEINASES LEUCOCYTAIRES ET BACTERIENNES : ROLE POTENTIEL DANS L'INFLAMMATION ET L'INFECTION PULMONAIRES

Chez les patients atteints de mucoviscidose, une des caractéristiques de la maladie au niveau pulmonaire, est l’association chronique d’une inflammation majeure avec présence massive de polynucléaires neutrophiles et d’une infection, le plus souvent par Pseudomonas aeruginosa. Cette bactérie opportuniste, ainsi que les neutrophiles, libèrent dans le milieu extracellulaire différentes protéinases qui peuvent agir sur des récepteurs cellulaires et ainsi avoir des activités physiopathologiques spécifiques. Une famille de récepteurs cibles pour les protéinases est représentée par les "protéinase-activated receptors" (PAR).

Ces récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G hétérotrimériques sont clivés à des sites spécifiques du domaine aminoterminal extracellulaire par certaines protéinases. Après le clivage, la nouvelle extrémité aminoterminale ainsi dévoilée se fixe sur la deuxième boucle extracellulaire du récepteur, entraînant son activation. Cette activation peut être reproduite par des peptides synthétiques correspondant à la nouvelle extrémité aminoterminale créée après le clivage protéolytique activateur. Parmi l'ensemble des quatre PAR connus, l’importance que nous avons accordé à PAR2 tient au fait qu’il joue clairement un rôle dans l’inflammation pulmonaire, même si ce rôle reste l'objet de débats.

Après avoir confirmé l’expression de PAR2 par des lignées de cellules épithéliales humaines bronchiques et alvéolaires (RT-PCR et immunocytométrie en flux), nous montrons que l'élastase et la cathepsine G, deux sérine-protéinases du neutrophile, ainsi que la métalloprotéinase élastolytique sécrétée par P. aeruginosa sont capables de le cliver dans ces cellules (disparition de différents épitopes antigéniques analysée par cytométrie en flux). Toutefois, nous n’avons pas observé d’activation cellulaire accompagnant ce clivage (voir Schéma A) comme cela peut l’être avec une protéinase activatrice de PAR2 comme la trypsine (mesure des flux calciques intracellulaires, de la production de médiateurs inflammatoires et de l'endocytose du récepteur). Au contraire, la pré-incubation des cellules avec ces différentes protéinases entraîne une neutralisation du récepteur qui devient réfractaire à une activation par la trypsine (voir Schéma B). L’activation par le peptide synthétique activateur de PAR2 SLIGKV- NH₂demeure cependant intacte (voir Schéma C), indiquant que le récepteur reste localisé à la surface cellulaire (confirmation par analyse par microscopie confocale), et n'est modifié par les protéinases leucocytaires et bactériennes que de façon limitée.

L’ensemble des résultats nous permet de conclure que les trois protéinases que nous avons étudiées clivent PAR2 au niveau du domaine aminoterminal extracellulaire, mais en aval du site de clivage activateur, expliquant ainsi à la fois l’absence d’un effet activateur et la présence d’un effet inhibiteur. Etant donné le rôle potentiel de PAR2 dans l’inflammation pulmonaire, nous pouvons ainsi proposer de nouvelles propriétés physiopathologiques pour l’élastase et la cathepsine G du neutrophile et pour l’élastase de P. aeruginosa.

Effets protéolytiques de l'élastase (HLE), de la cathepsine G (CG) leucocytaires et de l'élastase de Pseudomonas aeruginosa (EPa) sur PAR2 dans les cellules épithéliales respiratoires. A, l’HLE, la CG et l'EPa n'entraînent pas d'augmentation du calcium intracellulaire. B, l'activation par la trypsine ultérieure à une exposition aux protéinases est diminuée. C, l'activation par le peptide SLIGKV-NH₂ n'est pas sensible à une exposition antérieure aux trois protéinases leucocytaires et bactérienne.

Impact de Bacillus anthracis sur l’expression de la phospholipase A2 sEcrEtEe de type IIA et de l’interleukine-8 : subversion de la rEponse inflammatoire pulmonaire

**Impact de Bacillus anthracis sur l’expression de la phospholipase A2 s**EcrEtEe de type IIA et de l’interleukine-8 : subversion de la rEponse inflammatoire pulmonaire